MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
???[關聯信息]
?? 細胞增殖及細胞毒理檢測實驗，被廣泛應用于評估一些影響細胞周期的因子，如：生長因子.細胞因子.有絲分裂原以及影響細胞分裂和增殖的藥物等，成為在醫學檢測、藥物檢測以及食品和環境安全檢測中的一個重要手段。??
?
[基本原理]
?? 噻唑蘭（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT），是一種可接受氫離子的化合物染料，帶正電荷，具有很強的細胞膜滲透性。當MTT進入活細胞中后，線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原成深藍色的MTT-甲臜結晶。甲臜結晶不具有細胞膜滲透性，將會被永久的保留在活細胞內，使活細胞著色。而死細胞一方面細胞膜被破壞不具有選擇透過性，另一方面不具有將MTT還原形成MTT-甲臜結晶的能力，將不會被著色。甲臜結晶在570nm波長處具有最高吸收峰，通過酶標儀檢測??OD570nm，??便能很好的反應體系中甲臜的生成量。而甲臜的生成量與活細胞數目成正比，用以評估細胞存活和增值狀況。??
[產品組分] ??
規格?? | ??1000次?? | |||
???試劑A：MTT（粉末）?? | ??50 mg?? | |||
??試劑B：MTT溶解液?? | ??12 ml?? | |||
??試劑C：甲臜溶解液?? | ??120 ml?? | |||
??說明書?? | ??1份?? | |||
[保存條件和有效期]
試劑A和試劑B需避光-20℃保存，試劑C放置于4℃保存。未開封試劑，有效期12個月。???
?
[使用方法]
A．實驗前試劑準備
??1. MTT溶液配置
?? 用5ml MTT溶解液直接溶解25mg MTT粉末配制成5mg/ml的工作液，過濾除菌，該溶液可4℃ 避光短時間保存（越短越好）。建議溶解后，直接將剩余液體小劑量分裝放到-20℃保存，能穩定保存3-6個月，避免反復凍融。??
??2. 甲臜溶解液??
甲臜溶解液低溫或者常溫保存可能會產生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混勻后即可使用。?????
B．MTT細胞增殖檢測
??1. 接種細胞：用含10%胎牛血清（FBS）的培養液配制成細胞懸液，調整細胞密度，以每孔??5×103~2×104個細胞接種到96孔板，每孔體積100μl，同時設置調零孔（培養基+MTT+甲臜溶解液），對照孔（細胞+相同濃度的藥物溶解介質+培養液+MTT+ 甲臜溶解液）。
??2. 37℃，5% CO2，培養24-72h。??
??3. 可選：對于貼壁細胞，去除舊的培養液，更換100μl/孔新鮮的培養液（不含酚紅）；對于懸浮細胞，離心96孔板，去除盡可能多的上清液。然后加入100μl/孔新鮮的培養液（不含酚紅）重懸細胞。??
??4. 每孔加入10μl MTT工作液（5mg/ml）。??
??5. 水平搖床上低速混勻1min后，放入37℃培養箱孵育4h。注：對于高密度的細胞（>100,000 個/孔）可縮短孵育時間至2h。??
??6. 對于貼壁細胞，直接吸掉舊的培養液，避免槍尖刮破單細胞層。對于懸浮細胞，離心收集細胞，去除培養液。??
??7. 加入100μl/孔甲臜溶解液，用槍充分混勻后放入37℃培養箱孵育4 h。??
??8. 孵育結束，放置在酶標儀上搖勻后，選擇570nm，測定吸光度。????
[注意事項]
??1. MTT溶液對溫度.光照和有菌環境比較敏感，較長時間保存需低溫、遮光并在無菌條件下保存。當溶液顏色變為灰綠色請勿使用。??
??2. MTT溶液在低溫下會凝固，請置于室溫或20~25℃，直到溶液全部溶解并混勻后使用。??
??3. 如使用96T板長時間進行細胞培養和檢測，為防止液體蒸發給檢測結果帶來的不穩定性，可在培養板的邊緣孔用無菌PBS，水或者培養液填充。??
??4. 在細胞培養板孔中加入甲臜溶解液后，在普通光學顯微鏡下注意觀察甲臜的溶解情況，當甲臜正好全部溶解時進行OD570nm的檢測最為準確，長時間的孵育將降低檢測的靈敏度。通常37℃孵育4小時左右，紫色結晶會全部溶解。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些。如果紫色結晶較大較多，溶解的時間會長一些。??
??5. MTT溶液具有弱毒性，甲臜溶解液具有腐蝕性，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套按照實驗室標準操作手冊進行實驗。??
?
