BCA蛋白定量檢測試劑盒
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
關(guān)聯(lián)信息
BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）是根據(jù)目前世界上最常用的兩種蛋白濃度檢測方法中的BCA（bicinchoninic acid，二喹啉甲酸）法研制而成，其基本原理是蛋白質(zhì)分子中的肽鍵結(jié)構(gòu)在堿性環(huán)境下能與Cu2+ 生成絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+，BCA試劑會靈敏的與Cu+結(jié)合，形成穩(wěn)定有顏色的復(fù)合物，并在562 nm 處有最大光吸收值，這樣通過判斷反應(yīng)混合液顏色的深淺便能測定蛋白含量。該檢測試劑盒能對蛋白質(zhì)進(jìn)行快速、穩(wěn)定、靈敏的濃度測定，檢測濃度下限最低達(dá)到20μg/ml，并在50-2000μg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。
試劑盒組分
| 名稱 | 規(guī)格 |
| BCA試劑A | 500ml |
| BCA試劑B | 15ml |
| BSA 標(biāo)準(zhǔn)品 | 10vails |
| 產(chǎn)品說明書 | 1 |
儲存及有效期
BCA試劑A、BCA試劑B室溫保存；BSA 標(biāo)準(zhǔn)品-20℃保存。試劑盒質(zhì)保期一年。
注：如果在寒冷天氣進(jìn)行運(yùn)輸，或在保存期間，試劑 A 或試劑 B 發(fā)生沉淀，可通過對溶液進(jìn)行溫和加熱和攪拌，使沉淀溶解。當(dāng)試劑盒發(fā)生變色或證明有微生物污染時，請將試劑丟棄。
樣本處理
1、將樣品的濃度稀釋或者濃縮到試劑盒的檢測范圍20-2,000μg/ml。
2、樣品中的干擾物質(zhì)不能含有或者超過額定量（詳細(xì)見附表）。
3、樣品中干擾物質(zhì)的處理方法：
1) 通過透析或凝膠過濾來除去干擾物質(zhì)；
2) 對樣品進(jìn)行稀釋，直到該物質(zhì)不再產(chǎn)生干擾為止。只有當(dāng)起始蛋白質(zhì)濃度足夠高，在稀釋以后，其濃度仍能保持在定量分析的范圍內(nèi)時，這種方法才有效；
3) 用丙酮或三氯乙酸（TCA）沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。將含有干擾物質(zhì)的液體成分丟棄，蛋白質(zhì)沉淀可復(fù)溶于超純水中，或直接溶解在堿性 BCA 工作液中；
4) 增加工作液中銅離子的含量（試劑 A 與試劑 B 的以 50:2 或 50:3 的比例混合制備工作液），這種方法可以消除銅螯合劑導(dǎo)致的干擾。
注：為了獲得最高的準(zhǔn)確度，必須對蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和待測樣品進(jìn)行相同的處理。
試劑準(zhǔn)備
1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋
按照下表制備一組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。向1瓶牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）中加入1 ml緩沖液，成為2mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品，最好使用與待測樣品相同的緩沖液。每一支2 mg/ml 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品足夠用于制備下表中所列出的任意一組稀釋范圍的標(biāo)準(zhǔn)品；每個稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的體積足夠用于3次重復(fù)檢測。
用于標(biāo)準(zhǔn)方案的稀釋方法如下：
| 標(biāo)準(zhǔn)液編號 | 稀釋液體積（μl） | 標(biāo)準(zhǔn)品體積（μl） | 標(biāo)準(zhǔn)液終濃度（μg/ml） |
| 1 | 0 | 300 | 2000 |
| 2 | 125 | 375μl of standard1 | 1500 |
| 3 | 325 | 325μl of standard 1 | 1000 |
| 4 | 175 | 175μl of standard 2 | 750 |
| 5 | 325 | 325μl of standard 3 | 500 |
| 6 | 325 | 325μl of standard 5 | 250 |
| 7 | 325 | 325μl of standard 6 | 125 |
| 8 | 400 | 100μl of standard 7 | 25 |
| 9 | 400 | 0 | 0 |
2、按50體積BCA試劑A加入1體積BCA試劑B(50:1)配制適量BCA工作液，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。
操作步驟
1、將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液按25μl/孔的要求，分別加入96T板的板孔內(nèi)；
2、各孔加入200μl BCA 工作液，置于水平搖床輕輕震蕩混勻，37℃放置30分鐘；
3、將96孔板冷卻至室溫，用酶標(biāo)儀測定A562吸光度（如果沒有該波長，540nm-595nm之間的任意波長均可測定）
4、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值和濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品濃度(使用與酶標(biāo)板相關(guān)聯(lián)的曲線擬合算法，二次方程等曲線擬合將會比簡單的線性擬合提供更加準(zhǔn)確的結(jié)果。如果手工對這些結(jié)果作圖，對于標(biāo)準(zhǔn)曲線上的各個點(diǎn)，采取點(diǎn)對點(diǎn)描畫曲線的方法，比直接進(jìn)行線性擬合的結(jié)果更好)
注意事項
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為20-2,000μg/ml。
2、樣品中各干擾檢測的物質(zhì)含量需低于臨界值。
3、BCA工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。
問題及解決方案
| 常見問題 | 原因 | 解決辦法 |
| 樣品不顯色 | 樣品中含有銅離子螯合劑 | 將樣品進(jìn)行透析、脫鹽或者稀釋；加大工作液中銅離子的濃度，如將A液和B液的比例調(diào)整為50:2 |
| 樣本中蛋白濃度過低 | 濃縮樣本 | |
| 空白孔吸光值正常，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔吸光值偏低 | 強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿緩沖液改變了工作液的PH值 | 將樣品進(jìn)行透析、脫鹽或者稀釋 |
| 選擇了錯誤的測定波長 | 在540nm-595nm之間的之間的波長范圍內(nèi)進(jìn)行測定 | |
| 樣品孔吸光值偏高 | 蛋白濃度過高 | 將樣品進(jìn)行稀釋 |
| 樣品中含有脂類或者脂蛋白 | 在樣品中加入2%SDS以去除脂類干擾 | |
| 所有孔包括空白孔呈現(xiàn)深紫色 | 樣品中含有還原劑或者胺類（如兒茶酚胺） | 將樣品進(jìn)行透析或者稀釋 |
