去內毒素試劑盒
使用說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷!
第1版（2016年04月修訂）
關聯信息
細菌內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁的特有成份，它是一種外源性致熱原，可通過激活巨噬細胞、中性粒細胞等引起炎性介質的釋放，導致機體的損傷，嚴重者可引發膿毒性休克甚至死亡。而內毒素又是生物制品的重要污染物，所以，對于直接進入人體或者動物體內的生物制品、藥品都必須嚴格控制其內毒素含量。因此，內毒素的去除對于一些生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。
原理
多粘菌素（Polymyxin）是由多粘芽胞桿菌（Bacilluspolymyxa）產生的一組多肽類抗生素。其中，多粘菌素B（PMB）能拮抗細菌內毒素，雖然他們的結合機理還存在很多爭議，但是它們之間是通過靜電作用，離子作用和親水作用等多種因素共同作用的結果是大家普遍接受的事實。本試劑盒基于這一原理利用親和樹脂中的多粘菌素B與內毒素特異性的結合去除樣品中的內毒素。親和樹脂的主要特性如下表：
| 規格 | 1.5 ml 預裝柱 |
| 結合能力 | ≥2,000,000 EU/ml 樹脂 |
| 配基 | 修飾的多粘菌素 B (PMB) |
| pH范圍 | pH 5-10 |
| 基質 | 4% 交聯的瓊脂糖凝膠 |
| 顆粒大小 | 90 μm |
| 保存溫度 | 2°C-8°C |
| 使用壽命 | 18 個月 |
| 平衡緩沖液 | 磷酸鹽緩沖液，pH 8.0 |
| 離子條件 | 0.1-0.5 M NaCl |
| 可耐受試劑 | 20% DMSO,，20% 乙醇，20% 甘油，1 M 尿素，300 mM 咪唑， 0.05% 吐溫-20， 10 mM DTT 等 |
產品組分
| 名稱 | 規格 |
| 親和樹脂 | 1.5 ml 預裝柱 |
| 再生緩沖液 | 250 ml |
| 平衡緩沖液 | 250 ml |
| 流速控制器 | 1 個 |
| 無熱原接收管 | 1 包 （3 支/包） |
| 無熱原槍頭（1 ml） | 2 包（6 支/包） |
| 說明書 | 1 份 |
*親和樹脂重復使用5次不改變結合效率
還需準備的設備和試劑
1. 純化柱支架
2. 0.1M NaOH和0.1M HCl，用于調節樣品PH值
3. 氯化鈉和乙醇
儲存及有效期
4℃保存，有效期一年。
適用范圍
蛋白，多肽，抗體，多糖等溶液中內毒素的去除，樣品最終的內毒素水平可低于0.1 EU/ml。
操作步驟
1. 樣品處理：結合內毒素的pH范圍為5-10，pH范圍7-8進行純化最佳。樣品在0.15-0.5M NaCl的條件可以明顯增強特異性吸附并降低非特異性吸附。純化之前可以使用無內毒素的5M氯化鈉、0.1 M NaOH或0.1M HCl來調節離子強度或PH值。
2. 活化樹脂：垂直裝配好預裝柱，去除頂部蓋子，打開流速控制器，使保護液流干。加入5ml再生緩沖液，調節流速控制器，保持流速在0.25ml/min（或10滴/min），待再生緩沖液流干后再加入5ml再生緩沖液，重復操作2次，以確保體系中無熱源（即內毒素）存在。（注意：第一次使用也必須進行本步驟。）
3. 平衡樹脂：加入6ml的平衡緩沖液，調節流速控制器，保持流速在0.5ml/min，流干平衡緩沖液，再按此操作重復2次。
4. 內毒素去除：將流速控制器關閉，使用無熱源槍頭加入樣品，打開控制器，控制流速不高于0.25ml/min，流出液體積達到1.5ml后，使用無熱源接收管收集樣品。待樣品流干后，再加入1.5ml-3.0ml的平衡緩沖液淋洗，收集淋洗液。檢測樣品濃度及所含內毒素水平。（如果流出樣品內毒素水平未能達到預期值，需要將預裝柱按照步驟2重新再生，然后上樣純化。）
5. 柱保存：預裝柱用完后，先用10ml平衡緩沖液平衡柱，待平衡液流干，加入1.5ml的再生緩沖液（含0.02%的疊氮化鈉），2℃‐8℃保存。
注意事項
1. 在使用本產品過程，請嚴格控制操作環境，防止外來內毒素污染純化過的樣品。
2. 試劑盒內物內毒素槍頭盒收集管開封后，一次性用完。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
問題及解決方法
| 問題 | 問題原因 | 解決方法 |
| 去除效率低 | 樣品的pH值過高或者過低，不在最適范圍 | 調節pH至7-8 |
| 樣品和親和樹脂孵育時間太短 | 降低樣品的流速，或者通過低溫孵育來解決 | |
| 去除或檢測系統受到外來因素污染 | 使用無熱源的實驗儀器，保證體系不受污染 | |
| 內毒素與目的蛋白結合太牢固 | 1. 優化樣品的pH，使它們解離 2. 增加接觸樣品與親和樹脂的時間 | |
| 樣品損失高 | 樣品通過非特異性作用結合在親和樹脂上 | 增加樣品和平衡緩沖液中NaCl的含量 |
| 目的蛋白與內毒素結合牢固 | 1. 優化樣品的pH，使內毒素解離出來 2. 增加接觸樣品與親和樹脂的時間 | |
| 樣品被污染 | 同一根柱子處理不同的樣品 | 盡量避免使用同一個預裝柱處理不同樣品。 如果無法避免，可以在處理一個樣品之后，用10-20 ml 2M NaCl淋洗樹脂，然后再處理另外一 種樣品 |
| 再生緩沖液出現渾濁 | 當再生緩沖液達到室溫時將會出現渾濁 | 使用之前在冰上冷卻再生緩沖液或者在4℃條件下進行再生 |
